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突破！北大学者首次在体外产生成熟的具有功能性的肝细胞

2019-11-14 17:16:01

2019年7月3日，北京大学邓宏魁，时艳及解放军总医院卢实春在Cell Research 在线发表题为“A two-step lineage reprogramming strategy to generate functionally competent human hepatocytes from fibroblasts”的研究论文，该研究开发了一种新的两步策略，模仿再生过程中的天然细胞 - 命运转化途径，以产生可扩增的肝祖细胞和有功能上的人肝细胞。该策略有望通过谱系重编程产生其他成熟的人类细胞类型。

在第一步中，研究人员使用5种肝转录因子的组合，将成纤维细胞诱导成人肝祖细胞样细胞（hHPLC），其可在体外稳定地扩增并有效地在体内移植；接下来，将hHPLCs化学诱导成成熟的人肝细胞（hiHeps），其分子特征与原代人肝细胞（PHH）高度相似。最重要的是，hiHeps可以大量产生并且在功能上能够代替PHH用于药物代谢评估，毒性预测和乙型肝炎病毒感染建模。总而言之，该研究结果突出了祖细胞阶段成功谱系重编程的优势。

2019年4月26日，北京大学邓宏魁研究组、解放军总医院卢实春以及复旦大学袁正宏合作在Science在线发表了题为“Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro”的研究论文，首次证明利用化学小分子调控细胞信号通路，实现了功能细胞在体外的长期维持，这为大量制备功能成熟细胞及其应用提供了可能。

在过去的几十年中，通过多能干细胞或通过谱系重编程从不同细胞类型转化成功能细胞。然而，对于许多功能谱系而言，这些策略遇到了主要挑战：体外产生的细胞很少获得成熟细胞的特性和功能。具体而言，大多数细胞保留了胎儿标志物的表达和/或缺乏成体标志物的表达，从而导致细胞状态不成熟。因此，开发一种新的方法来生成体外所需的细胞仍然是一个挑战，这种细胞类似于从天然组织中分离的细胞。

通过确定的因子从成纤维细胞产生人肝祖细胞样细胞（hHPLC）

与多能干细胞分化不同，直接谱系重编程需要相对较少的来自人类胚胎发育的线索，特别是晚期胚胎发育阶段。以前的研究表明直接谱系重编程在体外以直接的方式产生各种人类细胞类型的可行性；然而，这种策略存在一些缺点，包括初始细胞的残余记忆和靶标功能受限。Zaret及其同事已经证明了重编程障碍，包括H3K9me3异染色质结构域，是导致初始细胞识别基因沉默不足和靶细胞类型基因调控网络激活受损的主要原因。克服这些障碍，将极大地改善谱系重编程产生的细胞功能。

体内hHPLC的成熟

在低等动物的伤口中，剩余的分化细胞首先可以通过去分化成增殖祖细胞来修复受损组织，然后进行广泛扩增，然后它们重新分化成功能成熟的细胞，重组组织。值得注意的是，祖细胞的增殖与表观遗传重塑相关，其允许祖细胞响应分化信号，以再分化成功能细胞。这表明两个重要原则：具有相对开放的染色质结构的祖细胞更易于细胞诱导，并且这种细胞的增殖允许产生丰富的功能细胞。这些体内再生原理可用于开发体外新的谱系重编程方法。

hiHeps在体外将成熟肝细胞表型重现为PHH

在这项研究中，研究人员开发了一种新的两步策略，模仿再生过程中的天然细胞 - 命运转化途径，以产生可扩增的肝祖细胞和有功能上的人肝细胞。在第一步中，研究人员使用5种肝转录因子的组合，将成纤维细胞重编程为增殖性肝祖细胞，然后可以在新开发的肝扩增培养基中选择和扩增；接下来，将肝祖细胞化学诱导成功能上有活力的肝细胞。综合分析显示，通过这种两步策略产生的肝细胞在细胞特性和功能上非常类似于新鲜分离的原代肝细胞，该研究具有广泛的药物发现和肝脏疾病建模应用潜力。

hiHeps对PHH的可比毒性预测能力

总之，该研究证明了两步重编程策略，其提供了在体外产生大量功能性感受态肝细胞的有效途径。遗传和化学方法的组合使得能够在重编程期间诱导可塑性的增殖祖细胞阶段，其通过克服重编程障碍促进细胞命运转化，并允许大规模生成期望的功能细胞。类似的策略可能成为在体外产生其他成熟细胞类型的一般途径。

关于肝细胞

肝脏是由肝细胞组成，肝细胞极小，肉眼看不到，必须通过显微镜才能看到。人肝约有25亿个肝细胞，5000个肝细胞组成一个肝小叶，因此人肝的肝小叶总数约有50万个。肝细胞为多角形，直径约为20-30/加（微米），有6-8个面，不同的生理条件下大小有差异，如饥饿时肝细胞体积变大。

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